https://doi.org/10.1089/neu.2020.7226

      创伤性脑损伤（TBI）传统上分为原发性和继发性损伤，均造成病理和形态的变化。TBI的损伤机制和慢性结局虽不能完全阐明，但突触稳态的失调和受损的能量代谢仍被认为是主要的原因。据推测，损伤周围细胞外三磷酸腺苷（eATP）的增加在其中扮演重要角色。在组织损伤后，细胞膜的破裂使细胞内的ATP释放到细胞外空间中，引发一系列毒性和炎症反应。ATP是普遍存在的信使，然而，仍缺乏简单而可靠的定量检测技术。

      该研究整合了一种敏感的生物发光的eATP感受器，pmeLUC，在可控皮质损伤小鼠模型中检测eATP的变化。

        利用腺相关病毒AAV构建含pmeLUC载体注射入新生0天(P0)的C57BL/6小鼠双侧脑室内使细胞膜带上pmeLUC。8周后小鼠腹腔注射15mg/kg D-荧光素，在接下来的12.5分钟内每30秒成像构建最大的术前基线内流值（光子数/秒）。成像后，小鼠在立体定向下接受可控皮质损伤模型构建，构建后注入150mg/kg D-荧光素，使用与基线值相同的参数成像。部分组的小鼠麻醉前尾静脉注射1mg/kg ATP磷酸酶(APT102)。术后30天取脑行切片进行HE染色。生物活体成像分析采用术后光子内流变化计算（ΔFlux）。统计采用two-way ANOVA和未配对t检验分析，P＜0.05为显著性标准。

      全脑成功转导入pmeLUC ATP生物传感器。在pmeLUC小鼠中制造CCI模型导致形态学的变化和炎症反应。pmeLUC生物传感器在CCL模型后捕获了eATP的增加。部分小鼠在CCL造模后注射入APT102显示荧光活动明显下降，证明pmeLUC可成功检测CCI后的eATP。

         图1. （A）质膜绑定的pmeLUC结构体原理图 （B）荧光素酶的酶促结构域暴露在细胞外空间。在ATP的作用下，荧光素酶催化D-荧光素的转化为光子。（C）小鼠脑切片矢状切面使用抗萤火虫荧光素酶免疫染色显示pmeLUC在注射PAAV9-CBA-pmeLUC-WPRE入小鼠体内一个月后在中枢神经系统CNS的广泛表达。(D)和（E）是C图部分的放大像，显示海马和皮层广泛的pmeLUC表达。（F）高放大率的皮质pmeLUC阳性神经元显示在质膜的局限性分布。（G）注射PAAV9-CBA-FLuc-WPRE（FLuc）的对照动物显示整个神经元的表达，包括核（黑箭头）。比例尺 C=2mm；D，E=300μm; F=50μm; G=100 μm。

       图2 pmeLUC小鼠的可控皮质损伤模型。（A）苏木精和伊红染色冠状切面的代表性图像显示CCI后的形态学变化。可以在CCI动物中看到皮质损伤和空腔。对相应区域的代表性踪迹进行数字化分析确定胼胝体（蓝色痕迹）和丘脑（绿色痕迹）的疾病负荷。（B）抗GFAP和抗Iba1对CCI和假手术动物在胼胝体和丘脑的免疫组化染色。（C）胼胝体和丘脑的GFAP和Iba1在单位面积的阳性像素计数定量（mm2）反映了CCI组和假手术组相比显著增加的信号。假手术组（n=4）,CCI(n=6)；p＜0.05=*，p＜0.01=**，p＜0.001=***；two-way ANOVA。比例尺 A=2 mm；B=50 μm。

       图3 在pmeLUC-CCL模型监测eATP变化。（A）IVIS成像在CCI手术前后的代表性图片。第一排和第三排（假手术前或CCI前）代表获取基线值时期的三个时间点（手术前），显示了逐渐增加的ATP信号。第二和第四排（手术后）代表术后获取的三个时间点。在CCI动物受影响的区域出现了信号的增加（B）。术后生物荧光信号的比较显示了eATP水平显著的变化，在假手术组（n=7）和CCI组（n=8）之间（p=0.0008；未配对t检验）。（C）APT102 ATP双磷酸酶治疗阻止了pmeLUC活性的升高。CCL手术前后溶剂和APT102处理的代表性的图片。（D）生物荧光信号的比较显示溶剂（n=4）和ATP双磷酸酶(n=5)在CCI动物模型之后出现显著不同(p=0.0483,未配对t检验)。

       图4 pmeLUC的动力学。（A）腹腔注射（IP）150mg/kg的D-荧光素后，生物荧光成像的代表性动力曲线。峰值信号在IP注射后1大约10分钟出现。动力曲线图代表假手术组(B)，CCL模型组(C)和CCI模型使用APT012(D)。点状直线和灰质间的区域提示在假手术和CCI手术持续的时间。

      综上，本文证实了一种可靠的、实时的测量啮齿动物脑细胞周围的eATP的活体生物传感器。这种新科技可在未来被有效用于研究脑损伤和神经失调病理过程中eATP的作用。