https://DOI: 10.1126/sciadv.abc3513

      脊髓损伤(SCI)具有灾难性的后果，创伤脊髓神经元的轴突通常被切断,从而引起一系列复杂的细胞和分子级联事件,包括炎症、神经元损伤和死亡等复杂机制。目前临床药物只能针对单一机制。此外，由于普遍存在的血脊髓屏障，极大地限制了它们在脊髓内的有效扩散，导致疗效不佳。因此迫切需要一种多功能、综合性的药物系统。

       这里，我们提出了基于一氧化氮气体分子的多效信使创新策略，用于神经损伤的高效修复和功能恢复。我们合成了一类新型的近红外光控一氧化氮释放体系（UCZNs）。该材料体系兼具神经再生和神经保护双重作用，以及快速的组织和生理屏障渗透能力，成功实现了活体脊髓损伤的高效修复和功能恢复，如图1所示。

图1. NIR-控制的NO释放用于SCI修复的原理图。将NO传递纳米系统由构建为由金属有机框架材料（ZIF-8）负载NO光化学供体（CysNO）包裹的UCNP构建。UCNPs将近红外光转化为蓝紫色光，可以裂解CysNO中的S - NO键，使NO释放。NO具有抑制胶质增生和炎症、促进神经元再生、保护神经元免受凋亡等多效性作用，可促进斑马鱼受损运动神经元轴突的生长，也可促进损伤SCI大鼠运动功能的恢复。

      通过热解法合成UCNP，对UCNP进行PVP修饰和ZIF-8包裹，装载CysNO，形成UCZN。利用Griess分析法定量分析UCZN在近红外光照射后NO的释放。利用CCK-8试剂盒和细胞活性/细胞毒性试剂盒检测PC-12细胞和DRG神经元在UCZN作用下的活性。使用NO荧光探针实时监测PC-12细胞中NO的释放。分别以剂量梯度和时间梯度分析PC-12细胞在不同UCZN浓度处理下，在第2，4，6天的细胞分化和细胞形态（新生神经突、神经元长度、生长比率）。使用TrkA或者钙通道阻滞剂处理细胞并观察，重复上述实验。

       饲养运动神经元荧光标记的转基因斑马鱼，接种六孔板。使用1%绝对乙醇构建SCI模型。利用荧光显微镜观察斑马鱼表型和死亡率，测量运动神经元的轴突长度。在SD大鼠中利用钳夹压迫（Clip-compression）构建SCI模型， UCZN用医用胶敷在吻合口，使用980nm激光照1min。大鼠BBB评分＜2。4周后利用步态分析系统分析大鼠恢复情况。4周前后大鼠脊髓分别进行免疫组化、荧光分析炎症指标表达变化。数据分析两独立样本使用双尾未配对t检验，多组使用one-way ANOVA分析。

图2. UCZN的合成与特征。(A) UCZN的制备。(B) UCNPs、UCNPs@PVP、UCNPs@PVP@ZIF-8@CysNO (UCZN)的TEM图像。(C) UCNPs (a)和UCNPs@ pvp @ zif -8 (UCZs) (b). (D) UCNPs@ pvp、UCZs和UCZN的红外光谱，绿色圆圈标记出RSNOs的特征峰。(E)产物在每一步的热重曲线，以及计算它们之间的差值。(F) UCNPs的荧光发射光谱和UCZN的紫外可见吸收光谱(波长300 ~ 440 nm)。(G)在近红外光激活或不激活的情况下，UCZN释放NO的量[百万分之160(ppm)]。NO的数量按照标准曲线(左上角)计算。每分钟开启/关闭近红外光(980 nm, 1.5 W/cm2)。(H)不同浓度UCZN在室温近红外光刺激下(980 nm, 1.5 W/cm2) 1周NO释放曲线。实线描绘了近红外光激活后1天内NO的大量快速释放。虚线表示在剩余的6天内NO持续缓慢释放。NO的总释放量与UCZN浓度和天数呈正相关，呈剂量依赖性和时间依赖性。这些特性对于按需NO生物分子近红外光释放对体内神经保护和神经再生具有重要意义。这些特性对于按需NO生物分子近红外光释放对体内神经保护和神经再生具有重要意义。

图3. 时空调控NO释放及促进PC12细胞生长。(A)用UCZN预培养的PC12细胞近红外刺激前后共聚焦显微镜图像。PC12细胞用NO绿色荧光探针(DAF-FM DA)染色。UCZN将980纳米的光转换成蓝紫色光。橙色方框为近红外光(980nm, 1.5 W/cm2)刺激后的ROI，蓝色方框为不受980 nm激光刺激的控制ROI。不同ROI的信号强度实时曲线显示在右边(比例尺,50mm)。(B)共焦显微镜图像钙黄绿素标记 PC12细胞后6天不同治疗(不同浓度UCZN有或没有近红外光谱光)图像(比例尺为50mm)。(C和D)PC12细胞分化的倾向(n = 20,组数= 5,以平均数±SD表示)和超过6天的PC12细胞的神经突数目(n = 5，组数= 6，平均数±SD),神经突的长度(n = 6，组数= 1,平均数±SD),和增长比率(n = 100，组数= 3，平均数±SD)。根据神经突的长度，定量地将生长水平分为L0 ~ L6。

图4. UCZN神经元调节机制的研究。(A) UCZN(蓝紫色)预培养的DRG神经元用显示[Ca2+]内流的绿色荧光探针(Fluo4 AM)染色。红方框设置为980nm激光下UCZN激活的ROI。其他ROI(黄色、橙色和蓝色方框)是从DRG神经元中选出来的，实时的信号强度曲线显示在右边(比例尺,50mm)。(B)近红外刺激前后GCaMP-X转染并与UCZN共培养的DRG神经元成像[Ca2+]。红方为经980nm激光照射(1.5 W/cm2)后的受激ROI。选定ROI的实时荧光强度的变化显示在右边（比例尺,200mm)。(C) PC12细胞的分化和神经突生长状态在非特异性钙离子通道阻滞剂LaCl3的存在下使用不同治疗方法(比例尺,50mm)。(D)细胞分化(n = 20，组数= 5，均数±SD)、神经元突数(n = 5，组数= 6，均数±SD)、神经元突长度(n = 6，组= 1数，均数±SD)与无LaCl3组比较的相关统计。*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001。

图5. UCZN修复斑马鱼和SD大鼠的脊髓损伤。(A) 斑马鱼脊髓的在不同治疗组的荧光图像 (比例尺,100mm)。运动神经元的轴突用红线标出。(B)平均轴突长度。(C、D)各组大鼠运动速度和时间(n = 3, 均数±SD)。(E) H&E受伤脊髓切片染色没有(a)或有(b) UCNP和980 nm的治疗(比例尺,2500mm)。代表性GFAP、IBA1、GAP-43和caspase-3的在病变和健康区域的免疫荧光图像:没有(c)和有(d) UCNPs + 980治疗(比例尺,200mm)。细胞核用DAPI(4 '，6-二氨基-2-苯基吲哚)蓝色染色。在H&E染色切片中，病变区和健康区分别用红色和蓝色矩形标记。(F)根据H&E染色切片分析病变区域(n = 3,均数±SD)。(G)根据相应的免疫荧光图像分析GFAP、IBA1、GAP-43和caspase-3的相对荧光区(n = 3,均数±SD)。*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001。

     在本研究中，我们构建了一个具有神经生成和神经保护双重作用的近红外-NO释放纳米系统，以有效修复创伤性SCI。在近红外光刺激下，NO的释放迅速达到生理水平，导致PC12细胞和DRG神经元的分化通路被激活，神经元过程出现明显的外生生长。体内实验表明,UCZN+980 nm激光辐照,大大促进了受损的斑马鱼运动神经元轴突以及促进SD脊髓损伤大鼠的运动康复，这是由于NO的多能作用包括胶质增生和炎症的抑制，减少神经退变，保护神经元减少凋亡。总的来说，基于NO气体分子的多效信使创新策略，克服了现有的脊髓损伤治疗药物存在的瓶颈问题，是对于脊髓损伤等神经损伤病症的高效修复和治疗的一个新的探索；更为有意义的是，该策略可为神经退行性疾病等更广泛的神经疾病治疗和组织工程方向的发展提供新思路。