脑内出血是最具灾难性的卒中形式且目前无有效治疗。ICH发病率和死亡率与溢出血块的占位积聚使脑组织移位造成的机械损伤，继发血块崩解造成的细胞毒性损害有关。细胞毒性的过程包含的生化机制有红细胞裂解产物，比如血红蛋白、血红素和铁离子，这些因子特有通过许多机制促进损伤的能力，包括氧化应激，脯氨酰羟化酶/缺氧诱导因子抑制和铁死亡。除了对存活神经元直接的有害作用外，这些因子导致的促炎反应也可致继发性脑损伤。

       乳铁蛋白（LTF）是自然产生的转铁蛋白家族的糖蛋白成员，被发现有抗微生物效应和免疫适应功能，有强力（~10-20M Kd）绑定和贮留游离铁离子以防止氧化应激的能力，是防控微生物感染，继发性系统炎症反应综合征（SIRS）和脓毒症的重要的一线防御分子。通过调节特异靶细胞应答，LTF连接了先天性和适应性免疫功能。重要的是，LTF能在毛细血管水平通过脑内皮细胞的转胞吞作用机制到达大脑。

       近期研究中发现LTF可以（1）减少溶血性产物对培养的神经元的毒性；（2）减少ICH影响脑组织中的脂质过氧化；（3）改善铁从ICH影响的脑中的祛除；（4）减少ICH导致的脑水肿；（5）减少ICH临床相关模型的随机盲法试验神经功能缺陷。总之，这些数据提示LTF和ICH的治疗存在显著相关。由于LTF在正常在循环中会被迅速清除（半衰期~15min）,这种特质会影响临床的应用。作者设计并成功产生了基于人LTF和免疫球蛋白G（IgG）的Fc结构域的新型融合蛋白，来增加这种优化LTF(Fc LTF)的治疗窗。本研究的目的是发展和构建一种新型有人相容性的基于LTF的化合物。这个结果为使用Fc LTF作为ICH新型单药治疗提供强力的证据。

       所有动物进行随机分组，应用盲法处理调查者和治疗分组。大小鼠ICH模型由纹状体内自体血输注构建，行为学分析每日上午10时与下午4时进行。使用一系列的个体测试评分和整合测试评分来计算临床神经功能缺损NDS。脑水肿测定利用干湿重法测定脑组织含水量=(湿重一干重)/湿重×l00%。分别向大鼠体内静脉注射相当于1mg/ml的Fc LTF 和rh LTF，特定时间点取血应用ELISA试剂盒进行分析半衰期。SD大鼠皮质神经元原代培养，加入裂解的红细胞，并使用0-5ug/ml Fc LTF处理48h，使用LDH和MTT试验分析细胞损伤程度。利用32Gyγ射线照射大鼠神经元制造凋亡模型，加入小胶质细胞观察吞噬现象，处理前30min分别加入0-5ug/ml的Fc LTF。所有数值以平均数±SD表示，使用One-way ANOVA和未配对t检验等进行统计分析。

      研究构建了LTF与IgG Fc段融合，将Fc LTF和rh LTF注入Wistar大鼠，在不同时间点从尾静脉抽血，用ELISA测浓度后发现Fc LTF与hLTF相比半衰期和平均滞留时间增加了5.8倍。接下来研究者分别利用培养的神经元检测Fc LTF是否可以限制溶血的血液毒性作用以及增加小胶质细胞对凋亡神经元的吞噬，结果如图1所示。

图1（a，b）Fc LTF减少体外红细胞裂解物的毒性。培养的12日龄SD大鼠皮质神经元在或不在Fc LTF存在下暴露于红细胞，细胞活力使用LDH释放（a）和MTT分析评估（b）。（c，d）Fc LTF增加体外细胞胞吞。条状图定量每单个大鼠小胶质细胞胞吞的死亡神经元（DN）数目（c）或红细胞（d）。Fc LTF给予0-5μg/mL。n=50或30提示检测到的内吞DN或红细胞的单个小胶质细胞数目。（e）小胶质细胞共聚焦代表性图像（绿色）吞噬了DN（红色）。细胞核使用DAPI染色（蓝色）。

       研究者又在大鼠中对Fc LTF进行了毒性检测，并进行全套实验检查。在所有参数在单剂量组中均未出现变化，连续剂量组中仅最大剂量（50mg/kg/天）出现明显的单核细胞数增多伴脾重量和红髓细胞数增加。研究者又利用了转化医学相关的自体血注射小鼠ICH模型中比较了rhLTF vs FcLTF在减少神经功能缺陷方面的能力（图2），结果提示rhLTF与 FcLTF显著减少了神经功能缺损。FcLTF的治疗效果优于rhLTF。

图2 比较Fc LTF vs rh LTF 在3月龄雄性ICH小鼠中减少神经功能缺陷（NDS）的效果。治疗在ICH后24h小时开始（100μL中10mg/kg，i.v.）然后第2天和第3天以100μL中1mg/kg口腔给药。第3天NDS评分在最后一次治疗后测量。条状图显示高级NDS（组合NDS评分由屈曲姿势，前置倾向，脚误和滚筒试验评价）在ICH后第1天个体的表现（在治疗前即刻）和第3天——在生理盐水、Fc LTF 或 rh LTF处理后的两天的表现。*P≤0.05，vs 生理盐水组在同一时间点（ICH后第3天）。#P≤0.05 Fc LTF 和 rh LTF组之间。数据呈现为平均数±SD，n=9只/组。

       使用3月龄雄性小鼠自体血注射ICH模型观察不同剂量Fc LTF对模型神经功能结局和脑水肿的变化的影响，发现小鼠接受1或5mg/kg Fc LTF治疗与对照组比能表现出显著行为学缺陷的减少。5mg/kg可能是最好的剂量，特别当评估ICH 10天后的结局。接受1或5mg/kgFcLTF治疗，而非0.1mg/kg，可以有效较少ICH后脑水肿。（图3）

图3 Fc LTF在小鼠ICH后模型NDS和脑水肿中的剂量应答。（a）第3天和第10天的高级NDS（4种试验的复合评分）和（b）ICH后第10天个体试验评分（屈曲姿势，前置倾向，脚误和导线测试）。N=10只/组。Fc LTF（0.1-5mg/kg）首次在ICH后三小时注射。第1天i.v. 后 第2天i.p.。*P≤0.05 vs 对照。（c）脑水肿=(湿重一干重)/湿重在ICH后3天影响同侧（Ipsi）和对侧(Contra)纹状体。数据呈现为平均数±SD，n=5只/组，*P≤0.05 vs 指示组)

      研究者又在5mg/kg探究了Fc LTF给予的最优治疗时机和时长。评估研究Fc LTF在ICH后3h和48h的治疗效能。治疗时长为ICH发病后3到5天。结果发现ICH后3h到6h给予治疗能高度有效地较少NDS。更有趣的是，延迟治疗至24h的效果相等（前提是连续治疗5天，单剂量24h后治疗无效，ICH 48h后开始治疗，包括连续治疗无效）。（图4）

图4  Fc LTF治疗小鼠ICH后神经功能缺陷（NDS）的方案效果。（a）小鼠接受Fc LTF（5mg/kg/剂）在ICH起病后3,6,24,48h。一些动物接受Fc LTF每日治疗2-5天，列在图中。第一次治疗为i.v.输注，继续的治疗为i.p.注射。高级NDS(包括屈曲姿势，前置倾向，脚误和导线试验的综合评分)在ICH后第1，第3，第7和第10天测定；数值为平均数±SD，n=10-12只/组，*P≤0.05 vs 对照。（b）每个在ICH后第10天的个体表现测试，*P≤0.05 vs 指示组。#P≤0.05 vs 所有剩余组。重复的two-way ANOVA 用来进行统计检验。

      年龄和性别作为ICH结局的重要因素，研究者利用20-24月龄的雄性和雌性小鼠建立ICH模型，1和5mg/kg的FcL TF在6h治疗窗内使用。首剂通过i.v.给药，剩余从第1日到第7日通过i.p.注射。对年长小鼠进行行为学评分发现，独立于性别和剂量，Fc LTF不影响第3日动物的表现。5mg/kg带来恢复改善在性别间类似（图5）。当将性别合起分析时，ICH的14天后出现明显改善。但分开统计后只显示在ICH后第21天有收益。不同性别组体重无明显差异。（图5）

图5 Fc LTF减少年长小鼠ICH后神经功能评分（NDS）。屈曲姿势，前置倾向，脚误和导线试验被用来产生ICH后第3，第7，第14，第21的复合高级NDS评分，在ICH后6h第一次给予1 或5mg/kg Fc LTF或生理盐水（载体）（i.v.），再额外6日每日给予剂量(i.p.)。n提示每组的动物数目*P≤0.05 vs 同样时间点的载体对照组。

       高血压是ICH的重要危险因素，研究者评估了Fc LTF在慢性高血压ICH动物模型中的保护作用。在SHR模型中造成ICH，给予1mg/kg Fc LTF治疗，首剂6h i.v, 后每日i.p. 连续7日，发现SHR在各测验中有显著的提高，在第7和第21日可以看到明显的改善。（图6）

图6 Fc LTF减少雄性SHR大鼠的ICH后神经功能评分（NDS），屈曲姿势，脚误，转角实验和胶带移除试验结果被用来计算ICH后第3，第7，第14，第21的高级NDS评分（100μL中1mg/kg，i.v.）FcLTF或生理盐水（载体）在ICH的6h首先给予，然后每日1mg/kg i.p. 给予额外6日。n=10/组 *P≤0.05 vs 同样时间点的载体对照组。

      这项新型的有前景的临床前研究显示了ICH中Fc LTF有力的临床作用。通过剂量优化研究，本文显示Fc LTF减少了老年雄/雌性小鼠、青年SD大鼠、自发性高血压(SHR)大鼠的ICH导致的神经损伤。Fc LTF保护神经元免受RBC的毒性作用，促进小胶质细胞对RBC和死亡神经元的吞噬。特别地，作者显示了Fc LTF至少有24h的治疗时间窗，并预测这种方法可能有广泛的临床应用。

       在本研究中，人体外数据提示LTF有贮留和中和毒性游离铁的能力，以防止血肿中溶血产物的细胞毒性作用，并为Fc LTF成为ICH治疗的候选分子提供逻辑性的证据。同时，由于溶血在ICH发展过程中相对较晚发生，本文为溶血产物毒性的干预提供了相对较宽的时间窗（至少24小时），但Fc LTF只有在ICH后24h给予，并继续治疗5天才有效果。单剂量的Fc LTF仍然不够。提示由Fc LTF针对的病理过程——包括铁毒性、炎症和吞噬细胞相关血肿消退——可能在ICH后持续几天。另外作者认为此项研究的限制为并未使用FcLTF超过5天，同时Fc LTF的用量为一日一次。考虑到FcLTF的衰减，更多的给药天数和给药频率应该进行测试。

        Fc LTF虽然在年长小鼠ICH模型中有效，但其稳健性远远低于年轻小鼠。Fc LTF在年长小鼠中5mg/kg才可起效（年轻小鼠1mg/kg）且开始起效的征象明显较晚（ICH 14天之后，年轻小鼠3天后即可出现改善），可能是ICH损伤在老年鼠脑中更加严重，且自我修复功能更差。在人类，年龄是一个带来ICH更差预后的无法改变的关键因素，提示年长可能造成更严重的损伤。与年长鼠同样，在使用SHR模型中，我们不能看到ICH后3天神经功能的改善。可能的原因是大鼠与小鼠相比血液在ICH后沉积的容积更大和/或者因为SHR的大脑在ICH损伤中受并存病影响更深。

       本研究也在体外表明了Fc LTF对于小胶质细胞吞噬功能的重要作用。巨噬细胞介导机制可以有效去除ICH后大量异位的红细胞和死细胞，去除炎症反应的来源，建立脑血管结构新稳态，促进恢复。这里我们发现Fc LTF促进了小胶质细胞/巨噬细胞对红细胞和死亡神经元的内吞，但同样，这些机制还需要在体试验获得数据以更好地为进入临床服务。