https://doi.org/10.1007/s12028-020-00931-5

       在急性脑卒中中，生物学标志物可以从“卒中模拟症状”（比如偏头痛和癫痫发作）中分别出真正的卒中病人，而能在院前从缺血性脑卒中"分诊”出脑内出血，加快诊疗速度，实现诊断特异性治疗。

       美国FDA最近批准了一项联合生物标志物测试，包括胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和泛素羧基端水解酶L1（UCH-L1)以减轻计算机断层扫描成像（CT）在轻型创伤性脑损伤中的应用负担。GFAP是一个细胞骨架蛋白，主要在星形胶质细胞中表达。它在生理条件下不会释放，因此，血液中健康个体的GFAP水平很低。UCH-L1是一种在神经元和神经内分泌细胞中发现的含量较高的酶，它保持了突触的可塑性和自我修复机制。GFAP作为急性脑卒中生物标志物的价值近年来被广泛研究。多中心研究显示ICH患者血样中GFAP快速增加，相比下缺血性脑卒中增加较慢。在起病1小时内，血清升高的GFAP水平提示ICH的一般敏感度为75-90%，特异性＞95%，并与ICH容量强烈相关。UCH-L1在卒中中研究相对较少。动物模型中，缺血性卒中发现了UCH-L1浓度的升高而ICH相对正常。

      本研究旨在探讨GFAP/UCH-L1在脑卒中中联合诊断的价值，鉴别缺血性卒中和卒中模拟症状中的ICH，并特别关注其在早期时间窗的价值。

       这项"脑卒中生物标志物快速诊断III"研究纳入两个中心，同时包括了院前环境和住院环境的急性卒中病人。通过移动卒中单元（MSU），研究招募了自2014年1月到2016年2月的院前病人。以及纳入2013年10月到2017年3月的住院病人。根据计算，最小纳入病人数为n=240（30 名ICH病人和210名缺血卒中病人)。

       所有入组病人进行急性卒中神经功能缺陷的筛查。入组标准：（1）有急性卒中的临床症状；（2）年龄＞18岁；（3）起病时间（或最后正常时间）至救护车≤4小时（院前情况），≤6小时（住院情况）；（4）对住院病人需要NIHSS评分≥4分。院前病人无此要求。排除标准：（1）近3月有卒中（包括缺血性和ICH）和TIA史；（2）近3月TBI史；（3）既往有脑肿瘤病史；（4）妊娠期妇女。记录以下临床变量基线值：年龄、性别、入院NIHSS评分、入院有无偏瘫、有无大脑半球相关临床表现（失语，忽视症，同向偏盲，强迫凝视，意识损害）、高血压史、糖尿病史，以及起病至入院时间窗。所有病人急性期接受脑成像检查。主要终点为病人出院的诊断，诊断基于ICD-10标准。

       使用ELISA方法测定入组病人血样中的GFAP和UCH-L1水平。使用天然GFAP和重组UCH-L1制作标准曲线，将待测生物标志物基于曲线拟合公式进行测定。血样由实验室技术员进行盲法测定。根据研究方法，每个病人在入院或卒中单元内进行一次脑成像（MRI或CT，无论何种方法），ICH位置由首次成像位置定义，并分类为”脑叶“和”深部“。如出现脑室内出血扩大，也予以记录。ICH体积由（a*b*c)/2方法定量。对于缺血性卒中患者，不定量梗死面积。

     因为GFAP和UCHL1血清浓度不呈正态分布，统计使用非参数Mann-Whitney U检验。使用非参数Spearman等级分析进行相关性检验。使用ROC曲线分析从缺血卒中分辨ICH的最优血清GFAP和UCH-L1的浓度，同时计算曲线下面积AUC。通过交叉表格计算灵敏度、特异性和阴性（PNV)、阳性预测值(PPV)。对于组合分析，使用以诊断为依赖变量，GFAP和UCH-L1为独立变量的logsitic回归模型。再用ROC分析和诊断准确性分析基于可能预测值进行分析，以α=0.05作为统计显著性水平。

      研究共入组了251名病人。平均中位数年龄72±15岁，56%女性。42名病人入组院前部分，209名病人入组住院部分。诊断工作发现院前有5名ICH，23名缺血卒中和14名卒中模拟症状；住院部分有59名ICH，148名缺血性卒中和2名卒中模拟症状。院前患者起病到抽血的平均时间130±79Min，住院患者136±86min。变量基线值见表1.

      血清GFAP水平在ICH病人中比缺血性卒中和模拟病人中高（中位数330 ng/L）[四分位数间距 64-7060，总距 8-56100] vs. 27.5ng/L  [14-57.25, 0-781，p＜0.001]。血清UCH-L1在ICH病人中也比在缺血性卒中和模拟病人中高，但相对差异明显比GFAP小（401ng/L [265-764，133-1812] vs. 338ng/L [213-549.5，0-2950，p=0.025]（图1）。

    ROC分析显示GFAP的AUC值为0.866（95%CI 0.809-0.924，p＜0.001）UCH-L1的值为0.590（0.511-0.670，p=0.033；图1c)。GFAP血清浓度为72ng/L被定义为从缺血性卒中和卒中模拟症状中分别出ICH的最优临界值。（敏感性 0.75 ，特异性 0.84；PPV和PNV见表2）。特异度为0.95时的临界值149ng/L（敏感性0.62），特异度为1.0时临界值为789ng/L（敏感性0.46）。UCH-L1血清浓度为291ng/L被定义为最优临界值。（敏感性0.73，特异性0.45）。评估两种标志物的整合模型与单独的GFAP相比只小幅增加AUC（0.873 [0.817-0.929]，p＜0.001）。最优敏感度和特异度分别为0.86和0.73（表2)。

      GFAP诊断准确性在年轻和年老病人中相比类似，在较不严重和更严重的神经功能缺损病人中类似，在起病后早期和晚期入院的病人中也类似（图2）。

      研究发现了GFAP和UCH-L1血浆浓度在ICH病人（Spearman rho 0.246, p=0.001)以及缺血性脑卒中的病人（0.296，p=0.018)中显著相关。GFAP与ICH容量强烈相关（0.679，p＜0.001）。对于 UCH-L1，并未看到与ICH容量的相关性（0.161，p=0.207）。表3 描绘了ICH病人的GFAP水平（分10级）和相应的ICH容量。我们并未发现GFAP和UCH-L1血清水平和ICH位置的相关性（平均GFAP：脑叶 8898±16928ng/L，深部6780±14131ng/L，p=0.406；平均 UCH-L1：脑叶 530±380ng/L，深部 626± 449 ng/L，p=736）。

         GFAP水平在ICH和缺血性卒中病人中与NIHSS相关。并未看到ICH患者中年龄、抽血时间和肌酐水平和GFAP的相关性。(图3a) UCH-L1与年龄相关，尤其缺血卒中病人。在ICH, UCH-L1和NIHSS相关。但仍然，与抽血时间、肌酐水平无明显相关（图3b)。

        我们观察到7名缺血性卒中患者有极高的UCH-L1水平（1905-2950ng/L，在非参数统计被称为极端值，图1b)。仔细观察这些病人均大于80岁（86±5岁）。NIHSS入院评分为4到24。平均抽血延迟时间146±93min。平均肌酐值正常范围（1.1±0.4mmol/L)，但平均CRP值升高（4.0±3.8mg/dL)。

       这项FDA批准的创伤性脑损伤生物标志物试验在脑卒中情况下证实了GFAP从缺血性脑卒中中分别出ICH的高诊断准确性的价值。对于UCH-L1，我们推测可能有更复杂的释放机制，对于ICH而言，跟单纯的血肿容积关联更少。目前的研究仍在概念证明阶段，由于生物分析仍在血样收集之后进行，并不直接在急诊或救护车”现场“进行。未来仍要更多试验检测GFAP作为一个即时系统提供ICH的快速诊断，并在院前启动诊断相关治疗的能力。

       这项试验前瞻性地评估了 联合GFAP/UCH-L1 生物标志物在诊断急性脑卒中中的价值。证实了GFAP血浆水平从缺血性脑卒中和卒中模拟情况中分别出ICH的诊断准确性，无论在任何的年龄、抽血时间分层和临床严重程度中。UCH-L1值也在ICH和缺血性卒中病人中有所不同，但鉴别价值较小。

      在本研究中，25%的ICH病人GFAP值低于临界值。但鉴于这些变异不与抽血时间和症状严重程度相关，具体仍不清楚。然而，本研究证实了ICH容量和GFAP值的强烈相关性。这表明细小的出血因没有脑组织的破坏和有限GFAP释放可能被忽略。这也适用于脑室内出血（没有脑实质受损）。因此，某种ICH容量的”自然下限“可能存在于本研究中。此外，由于技术进展，未来能更好改善其灵敏度。比如所有缺血卒中病人有较低的GFAP值，临界值789ng/L为100%的阳性预测值。但阴性预测值仅有84%。因此，该试验可能更能检出ICH而非排除ICH。

       UCH-L1的结果可能需更复杂的解释。UCH-L1分别ICH的能力较GFAP弱，且部分缺血性卒中的病人出现UCH-L1的强烈升高。可能的解释为这些病人年龄上超过80岁。由于UCH-L1被用来预测TBI，这些患者可能在卒中发作前有跌倒。此外，由于UCH-L1分子量小（24kDa），更容易通过血脑屏障而被检测。

       GFAP是星形胶质细胞大量表达的蛋白以维持细胞骨架。GFAP在ICH中的释放可能是由于扩大的血肿对星形胶质细胞的”被动“破坏导致，而非由于主动的胶质增生。因此，GFAP在ICH起病的早期时间窗中可能较少。本研究中，也发现GFAP的准确性在起病2至6小时最佳。在缺血卒中中，GFAP延迟增加，由于逐渐的星形胶质细胞坏死在血管阻塞后6-12小时开始。UCH-L1存在于神经元和神经内分泌细胞中，血肿扩大也可造成神经元破坏释放蛋白。但本文中UCH-L1与ICH容积不相关，提示其机制可能较复杂。此外，在缺血卒中病人急性期中UCH-L1会增加而GFAP一般不会。总之，GFAP的ICH较好预测性可以帮助早期启动ICH相关的治疗（如降压、促凝等）。

       本研究的一项不足是病人到达医院进行抽血的时间和入住卒中的单元抽血的时间没有较大差异，无法反应多样的时间窗范围。另外，相对于院前病人，住院病人年纪可能更大、有更多出血和位于大脑皮质的ICH，以此可能造成的不平衡。然而，本研究仍然试验了最近FDA批准的预测TBI患者的生物标志物GFAP和UCH-L1在卒中中的预测价值，并且对于急性卒中患者的生物样本收集的准入标准，具有参考价值。